【一(yī)
，分(fēn)子(zǐ)生物學與(yǔ)基因測序(xù)行(háng)業(yè)實(shí)驗檢(jiǎn)測(cè)背景與需求】

跟(gēn)隨(suí)準確(què)醫(yī)療(liáo)以及(jí)基(jī)因(yīn)組學研究(jiū)迅猛(měng)發展的步伐, 二代測序也就(jiù)是(shì)NGS技術已然(rán)變成(chéng)臨(lín)床診(zhěn)斷(duàn)
，藥物(wù)研(yán)發(fā)還有基礎科研(yán)的核心(xīn)工(gōng)具(jù), 依據(jù)行業標準, 在(zài)NGS文(wén)庫(kù)製備(bèi)進程之(zhī)中, 決定後續(xù)測(cè)序質(zhì)量的關(guān)鍵環節(jié)是(shì)DNA片段化(huà), 傳統(tǒng)的酶(méi)切法或(huò)者(zhě)機(jī)械(xiè)剪切法存(cún)在片段均(jūn)一性(xìng)糟糕
，操作(zuò)繁(fán)復
，交叉(chā)汙染風險(xiǎn)高等諸多(duō)問題, 特別是(shì)在(zài)處理FFPE樣本
，微(wēi)量(liáng)DNA或者(zhě)稀有樣(yàng)本時(shí), 怎樣在(zài)確(què)保核酸(suān)完整性(xìng)的(dí)前(qián)提(tí)條(tiáo)件下(xià), 實現(xiàn)高重復性(xìng)
，窄分(fēn)布(bù)範圍的DNA片段獲取(qǔ), 這成(chéng)為(wéi)實驗室所(suǒ)麵臨(lín)的普(pǔ)遍挑戰(zhàn)。行(háng)業急切需(xū)要一(yī)種自動(dòng)化DNA剪(jiǎn)切設(shè)備, 它是非(fēi)接觸(chù)式的(dí), 具(jù)備(bèi)高(gāo)通(tōng)量(liáng)特點(diǎn), 且溫控準(zhǔn)確, 以此(cǐ)來滿(mǎn)足NGS文庫製備（WGS
，WES）
，ChIP-seq
，ATAC-seq等前(qián)沿實驗(yàn)對(duì)樣本(běn)前處(chǔ)理(lǐ)的(dí)嚴格苛刻(kè)要(yào)求(qiú)。萊恩德(dé)DNA剪切儀正(zhèng)是針(zhēn)對(duì)這一需(xū)求所設(shè)計(jì)的(dí)專業解(jiě)決辦(bàn)法。

【二(èr)
，實驗所需儀器與試劑(jì)】

核心儀器(qì)：萊恩(ēn)德(dé)DNA剪(jiǎn)切儀（型號LD-D100）

萊恩(ēn)德(dé)LD - D100型(xíng)DNA剪(jiǎn)切(qiē)儀運用(yòng)非(fēi)接(jiē)觸式超聲(shēng)波片(piàn)段(duàn)化技術, 借助(zhù)超聲(shēng)波空化效果, 於封閉試管當中(zhōng)達(dá)成對DNA分子的精確打(dǎ)斷。這個設備裝(zhuāng)備著7英(yīng)寸醫(yī)療級(jí)別的液晶觸(chù)摸(mō)屏(píng), 它(tā)能夠支持(chí)超聲時(shí)間的靈活設定, 也可以支持(chí)間(jiān)隙時(shí)間(jiān)的靈活設定(dìng), 它同(tóng)樣(yàng)支持(chí)超聲功(gōng)率的(dí)靈(líng)活(huó)設定(dìng), 還(huán)支(zhī)持(chí)報警溫度(dù)等參(cān)數(shù)的靈(líng)活(huó)設定, 並(bìng)且它(tā)擁(yōng)有樣(yàng)品(pǐn)溫度(dù)的實時(shí)監(jiān)測(cè)功(gōng)能, 它(tā)也具備混頻超(chāo)聲(shēng)功能(néng), 其頻率(shuài)會自適(shì)應(yīng)到23KHz, 以(yǐ)此(cǐ)來確保(bǎo)不同GC含量的DNA樣(yàng)本能夠得(dé)到(dào)理(lǐ)想的片段化效果, 也確(què)保復(fù)雜(zá)結構的(dí)DNA樣本(běn)能夠獲得(dé)理想的(dí)片段(duàn)化效果。它(tā)的通量(liáng)配置(zhì)有(yǒu)著靈活(huó)性, 能夠(gòu)選(xuǎn)擇配備像30×0.2mL
，20×0.5mL
，8×2mL
，5×5mL這樣多(duō)種的混合支架(jià), 用以滿足(zú)從微量到(dào)中等通(tōng)量(liáng)的實驗(yàn)需求。另外(wài), 該(gāi)設備(bèi)擁有(yǒu)外置(zhì)低(dī)溫水浴接口(kǒu), 能夠連(lián)接(jiē)冷(lěng)水(shuǐ)機或者(zhě)循環浴(yù)槽(cáo), 精(jīng)確控(kòng)製(zhì)樣品(pǐn)溫(wēn)度處於2至40℃的範(fàn)圍之(zhī)內, 有效(xiào)地防止因熱損傷(shāng)引(yǐn)發(fā)的(dí)樣本變(biàn)性(xìng)。故(gù)障自(zì)動報警功能(néng)保(bǎo)證儀(yí)器運(yùn)行安(ān)全且(qiě)穩定。

配(pèi)套(tào)試(shì)劑與耗(hào)材(cái)

核酸純(chún)化(huà)後(hòu)的DNA樣(yàng)本(běn)（推薦(jiàn)濃度(dù)10-200ng/μL）

具備低吸(xī)附(fù)特性的(dí)微(wēi)量離心管, 其容量規(guī)格(gé)有0.2mL
，0.5mL以及2mL, 需依(yī)據具體的(dí)支架規(guī)格來(lái)進行選(xuǎn)擇。

TE緩衝液(yè)（pH 8.0）或(huò)無(wú)核酸(suān)酶(méi)水用於樣(yàng)本稀釋(shì)

DNA純化(huà)磁(cí)珠或柱(zhù)純(chún)化試劑(jì)盒(hé)（用(yòng)於片段化(huà)後產物(wù)回(huí)收(shōu)）

低溫循環水(shuǐ)浴或(huò)冷水(shuǐ)機（可選配，用於(yú)控溫(wēn)）

冰盒(hé)或低溫冰浴(yù)裝(zhuāng)置(zhì)（用(yòng)於(yú)樣本(běn)臨(lín)時保(bǎo)存(cún)）

【三(sān)
，標準實(shí)驗(yàn)操作方法】

樣品(pǐn)前處理(lǐ)

把(bǎ)要(yào)進行剪(jiǎn)切的DNA樣(yàng)本, 用(yòng)TE緩(huǎn)衝液或(huò)者(zhě)無(wú)核酸酶(méi)水(shuǐ), 稀(xī)釋成(chéng)所需要的濃度, 進行充分(fēn)混匀(yún)之後(hòu), 轉移(yí)到(dào)適配的(dí)微量離心(xīn)管(guǎn)裏頭。要確保樣本(běn)的體(tǐ)積(jī), 不會超過(guò)試(shì)管容(róng)量(liáng)的(dí)80%, 防止(zhǐ)超聲過(guò)程中(zhōng)液體(tǐ)濺(jiàn)出來(lái), 或者產(chǎn)生氣泡(pào)。對(duì)於FFPE樣本或(huò)者(zhě)低豐度樣(yàng)本, 建議先用DNA質(zhì)量評估(gū)的方(fāng)法（比如瓊脂糖(táng)凝膠電(diàn)泳, 或者(zhě)Qubit定量(liáng)）, 來確認(rèn)樣(yàng)本的降解程(chéng)度, 再(zài)酌(zhuó)情去(qù)調(tiáo)整(zhěng)起(qǐ)始的(dí)量(liáng)。

儀(yí)器(qì)準備與設置

打開萊恩德LD-D100電源，進入觸摸屏主界(jiè)麵。按照(zhào)實(shí)驗(yàn)需(xū)求(qiú)來設(shè)定參數(shù), 對於超聲時(shí)間(jiān), 建議(yì)剛開(kāi)始(shǐ)設定為(wéi)5到(dào)15分鐘, 這(zhè)要(yào)依據目(mù)標片段大小來確(què)定, 單次(cì)超聲(shēng)時(shí)間設定成(chéng)30秒(miǎo), 間隙(xì)時間設定(dìng)為30秒, 以此(cǐ)來(lái)防止樣(yàng)品過熱(rè), 與此(cǐ)同時, 超(chāo)聲功率(shuài)推薦設(shè)置(zhì)在200到(dào)400W之(zhī)間, 需(xū)按照(zhào)實際樣本粘稠(chóu)度(dù)進行(háng)調(tiáo)整, 報(bào)警溫度設定為30℃。要是需(xū)要進(jìn)行(háng)控溫(wēn), 那就連接外(wài)置(zhì)的冷(lěng)水機(jī), 設(shè)定(dìng)水浴的溫度(dù)為4到(dào)10℃。把裝有(yǒu)樣(yàng)本的試管放置(zhì)到適(shì)配(pèi)的支(zhī)架裏邊, 要(yào)保(bǎo)證支架可以正常(cháng)工作的旋轉(zhuǎn)電機, 也(yě)就是(shì)電(diàn)池驅(qū)動(dòng)的那(nà)種(zhǒng), 讓(ràng)試管(guǎn)在超聲水(shuǐ)槽(cáo)內(nèi)部均匀地旋轉, 以(yǐ)此確保所有(yǒu)樣本(běn)都(dū)能(néng)接(jiē)受一致的處理。

實驗操作步驟

將設(shè)備(bèi)啟(qǐ)動起來(lái), 去(qù)點擊那(nà)個(gè)被(bèi)稱(chēng)作“開(kāi)始”的按鈕(niǔ)。儀器會自(zì)行(háng)開(kāi)展預設(shè)好(hǎo)的(dí)超(chāo)聲(shēng)程序。在這(zhè)個過程當中, 能夠借助(zhù)觸(chù)摸(mō)屏對樣品溫度以(yǐ)及超(chāo)聲(shēng)狀態做(zuò)實時(shí)監(jiān)測。要是察覺(jué)到溫度快要(yào)接(jiē)近報警值(zhí), 或者出現了(liǎo)異常的噪音, 那(nà)就得立(lì)馬(mǎ)暫(zàn)停程(chéng)序, 瞅(chǒu)瞅(chǒu)樣品(pǐn)密封(fēng)得好(hǎo)不(bù)好, 或者(zhě)水槽液(yè)位(wèi)是否(fǒu)處(chǔ)於(yú)正常狀(zhuàng)態。等程(chéng)序(xù)結(jié)束(shù)以(yǐ)後(hòu), 把試(shì)管(guǎn)取出(chū)來(lái), 進行(háng)短(duǎn)暫(zàn)的離(lí)心操(cāo)作(zuò)（轉速(sù)為10000rpm, 時長(cháng)10秒）來(lái)收(shōu)集(jí)管壁(bì)上(shàng)的(dí)液體(tǐ)。

數(shù)據(jù)采集(jí)與處理

將經過片段(duàn)化(huà)的(dí)DNA樣本, 按磁珠(zhū)法或者柱純化法(fǎ)來(lái)實(shí)施(shī)純(chún)化(huà)操作, 進(jìn)而把大片段以及(jí)小片(piàn)段(duàn)雜質(zhì)予以去(qù)除(chú)。取適(shì)量(liáng)已純化(huà)的產物運(yùn)用瓊脂糖凝(níng)膠電(diàn)泳或者(zhě)微流控芯(xīn)片(piàn)電泳如Agilent 2100 Bioanalyzer進(jìn)行檢(jiǎn)測(cè), 以此評(píng)估片段(duàn)分布範圍(wéi)比如主峰(fēng)處於200 - 400bp區(qū)間且符(fú)合NGS文庫構(gòu)建要求。依(yī)檢(jiǎn)測(cè)的結果來(lái)看(kàn), 要(yào)是片段偏大(dà)的話, 那麼能夠適當地(dì)增添超(chāo)聲(shēng)之(zhī)時(shí)的時長亦(yì)或(huò)是功率(shuài)；要(yào)是片段過小(xiǎo)的話, 那(nà)就(jiù)得降(jiàng)低處(chǔ)理強度。每(měi)進行(háng)一回實驗, 建議涵(hán)蓋(gài)陽(yáng)性(xìng)對(duì)照(zhào)（也就(jiù)是已知(zhī)片段(duàn)大(dà)小的那(nà)種標準DNA的呀(yā)）以(yǐ)及(jí)陰性對照(zhào)（即無(wú)核(hé)酸酶的水的(dí)了）, 以此使結果(guǒ)可以被(bèi)追(zhuī)溯過(guò)來的。

【四
，實(shí)驗(yàn)結(jié)論(lùn)與方案優(yōu)勢】

運用萊恩德(dé)LD-D100型(xíng)DNA剪切儀開(kāi)展DNA片段化(huà)實(shí)驗, 可穩定(dìng)獲(huò)取(qǔ)處(chǔ)於200 - 400bp範(fàn)圍(wéi)之(zhī)內(nèi)的(dí)均一性片段(duàn), 符合(hé)WGS
，WES等主流NGS文(wén)庫(kù)製(zhì)備關(guān)於片段長度的嚴(yán)格要求。此(cǐ)方(fāng)案於操作便捷性
，數(shù)據(jù)重復(fù)性(xìng)以及(jí)樣本(běn)安全(quán)性方(fāng)麵(miàn)展現出色: 非接觸(chù)式(shì)設(shè)計全(quán)然規(guī)避了(liǎo)樣本(běn)間(jiān)交叉(chā)汙染, 混頻(pín)超(chāo)聲技術(shù)提(tí)高(gāo)了對復雜序列(liè)的(dí)剪切效率(shuài), 準(zhǔn)確(què)溫控係統切(qiē)實(shí)保護了(liǎo)核酸(suān)完整性(xìng)。對(duì)於基因測(cè)序公(gōng)司, 還(huán)有(yǒu)醫(yī)學檢(jiǎn)驗所(suǒ), 以(yǐ)及科研實驗室來講, 萊(lái)恩(ēn)德DNA剪切(qiē)儀能夠(gòu)明顯提高文庫構(gòu)建效率, 還(huán)能降低人(rén)工(gōng)操(cāo)作(zuò)誤差, 與此(cǐ)同時, 它(tā)可(kě)以滿足食品(pǐn)安(ān)全國家標準GB/T 37864 - 2019等法規(guī)針對生(shēng)物(wù)樣(yàng)本前(qián)處理所(suǒ)提(tí)出的(dí)規範(fàn)性要求, 是(shì)取代傳(chuán)統酶(méi)切(qiē)法與接觸式超(chāo)聲法的(dí)理(lǐ)想(xiǎng)選擇。

【五
，參考文(wén)獻(xiàn)/相關標(biāo)準】

《食品(pǐn)安全國家(jiā)標(biāo)準》, 其(qí)中(zhōng)一項是(shì)關(guān)於(yú)食品微生物(wù)學(xué)檢驗(yàn)的總(zǒng)則(zé), 其(qí)標準編(biān)號為GB 4789.1 - 2016。

《核(hé)酸提取, 純化以及片(piàn)段化(huà)技(jì)術規範(fàn)》, GB/T37864 - 2019。

用於(yú)二代測序的文(wén)庫構建的通用技(jì)術(shù)規(guī)範, 此(cǐ)規範源自美國(guó)Illumina官(guān)方(fāng)提(tí)供(gōng)的(dí)文(wén)庫製備指南。

, Sambrook, J. 以(yǐ)及(jí) Russell, D.W. 於(yú)2001年出版(bǎn)了《Molecular Cloning: A Laboratory Manual》第三(sān)版 , 由 Cold Spring Harbor Laboratory Press 出版。

針對(duì)非接(jiē)觸(chù)式(shì)超(chāo)聲DNA片段化, 展開(kāi)方法(fǎ)學(xué)比較研(yán)究, （該研究發(fā)表(biǎo)於(yú)）《生(shēng)物分(fēn)子(zǐ)技術(shù)雜(zá)誌(zhì)》, 時(shí)間是(shì)2019年(nián)。